Осветительная система светового микроскопа

“…Поэтому знать роль освещения в видении микроскопических объектов является существенно важным. Только тот владеет микроскопом до конца, кто знает также, как нужно манипулировать ирисовой диафрагмой под конденсором и чего можно и нужно добиваться". академик Д.С. Рождественский

Осветительные системы микроскопов играют весьма важную роль для формирования изображения исследуемого объекта максимально достоверного оригиналу. При получении на микроскопе изображения микроскопического объекта нужно не потерять детали. Микрообъект, любые самые крохотные его участки требуется конгруэнтно изобразить в масштабе без искажений формы и нарушения цветности. Требуется самое внимательное отношение к деталям. Отсюда вытекает суть теории светового микроскопа, научная основа теории разрешающей способности и теории исправления аберраций в микроскопе. В теории микроскопа качеству и функциональности осветительной системы отводится весьма важное место. В теории разрешающей способности микроскопа параметры осветительной системы приравниваются к параметрам объектива. Теория микроскопа и микроскопирования доказывают, что именно два этих узла определяют “мощность” микроскопа, его разрешающую способность.

Разрешающая способность микроскопа напрямую зависит и от числовой апертуры объектива и не меньше зависит от числовой апертуры осветительного устройства (в упрощенном понимании – конденсора). Этот постулат легко проверить, изменив (увеличив) в биологическом микроскопе апертуру конденсора, нанеся на его фронтальную линзу каплю иммерсионной жидкости (увеличив такой важный параметр, как числовая апертура конденсора), и сравнив “тонкость и точность рисунка” изображения объекта с аналогичным изображением без иммерсии на конденсоре. Другое дело, что на практике редко наносят иммерсионную жидкость на конденсор, капля растекается, подсыхает и тп, привнося определённые неудобства. Но согласимся, что не использование иммерсии в конденсоре не позволяет реализовать на микроскопе максимальную разрешающую способность. Наряду с таким показателем осветительного устройства микроскопа как числовая апертура конденсора важную роль для получения качественного изображения на микроскопе играет аберрационная коррекция конденсора. Не только объектив, но и конденсор (осветительное устройство микроскопа) должны иметь качественную аберрационную коррекцию.

Рис. 1. Классическое представление микроскопа

В соответствие с классической теорией микроскопа обязательно в конденсоре (осветительном устройстве) микроскопа исправляется т.н. аберрация неизопланатизма, поскольку изображение источника света должно быть стигматично и обеспечивать высокую равномерность освещения изучаемого объекта. Классическим примером является двухлинзовый конденсор Аббе (с одной несферической поверхностью в современных модификациях). Описание такого конденсора не сложно найти в общедоступных источниках. Такие конденсоры комплектуют подавляющее большинство учебных, рабочих и лабораторных микроскопов. На рисунке отражено классическое представление о микроскопе как об оптическом приборе, формирующем изображение мелких объектов, не различимых при обычном визуальном наблюдении. Из рисунка видно, что для достижения максимальной разрешающей способности на микроскопе (т.е. обеспечение “рассмотрения” минимального размера структуры объекта) требуется использование конденсора и объектива, имеющих одинаковую числовую апертуру (в идеальном случае – использование двух одинаковых объективов, одного из них в качестве конденсора).

Рассмотрим варианты решений осветительных систем световых микроскопов. Итак, если свет (или часть его), идущий из осветительного устройства, попадает непосредственно в объектив, то фон выглядит светлым, поэтому такое освещение называется освещением по методу светлого поля. Если размер источника света для освещения объекта достаточно велик, то в простейшем случае его располагают на определенном расстоянии “а” от плоскости предмета.

Если расстояние “а” определяет положение плоскости, оптически сопряженной с апертурной диафрагмой объектива, как показано на следующем рисунке, то минимальный размер l* источника света, заполняющего светом числовую апертуру А объектива определяется соотношением:

Рис. 2. Освещение предмета непосредственно источником света

На рисунке представлен вариант освещения предмета непосредственно источником света. Очевидно, источник света можно расположить ближе или дальше этой плоскости при условии его изображения в апертурной диафрагме объектива с допустимой величиной расфокусировки, то есть в этом случае все лучи, проходящие через каждую точку плоскости предмета в обратном направлении, должны попадать на поверхность источника света.

Из конструктивных соображений между плоскостью предмета и источником света можно расположить плоское зеркало, как показано на следующем рисунке. Если источник света достаточно мал, то плоское зеркало можно заменить вогнутым, которое формирует увеличенное изображение маленького источника света как показано на другом рисунке.

На следующем рисунке представлен вариант освещения плоским зеркалом.

Рис. 3. Освещение плоским зеркалом

На следующем рисунке представлен вариант освещения с вогнутым зеркалом.

Рис. 4. Освещение с вогнутым зеркалом

Однако, при средних и больших числовых апертурах микрообъектива протяженности источника света или увеличения ее с помощью вогнутого зеркала, как правило, недостаточно. Именно для достижения требуемых размеров изображения источника света применяют специальные оптические системы, называемые конденсорами.

Способ освещения, когда источник света конденсором изображается непосредственно в плоскости предмета, раньше применялся очень широко. В Англии он был назван “критическим способом освещения”.

Для того чтобы плоскость предмета была освещена равномерно, источник света должен излучать энергию по всей своей поверхности равномерно. На практике такие источники света встречаются редко. Поэтому в настоящее время используются обычные источники света в соединении со специальной дополнительной оптической системой, названной коллектором.

Естественно, осветительная система светового микроскопа несколько усложняется, однако позволяет обеспечить качественное равномерное освещение, в полной мере обеспечивающее требуемую апертуру и разрешающую способность.

Итак, входной зрачок конденсора оптически сопряжен с апертурной диафрагмой объектива; в плоскости входного зрачка конденсора располагается ирисовая диафрагма, выполняющая роль апертурной диафрагмы оптической системы микроскопа. Если наблюдать отверстие коллектора из точек образованного им изображения источника света, то оно будет выглядеть одинаково ярким по всей поверхности. Конденсор, в свою очередь, изображает ирисовую диафрагму, расположенную в непосредственной близости к коллектору, в плоскости предмета. Таким образом, ирисовая диафрагма во входном зрачке конденсора служит для регулировки заполнения светом выходного зрачка объектива, а ирисовая диафрагма вблизи коллектора – для регулировки величины освещаемого поля. Этот способ впервые был предложен Кёлером и называется освещением по методу Кёлера.

На представленном ниже рисунке (“одинаковых” рисунках) изображена принципиальная оптическая система светового микроскопа с осветительным устройством, формирующим освещение по методу Кёлера. Оптические системы отдельных узлов схемы заменены условными главными плоскостями. Коллектор 2 изображает источник света 1 в апертурную ирисовую диафрагму 4 конденсора 5, который проецирует полевую диафрагму 3 коллектора в плоскость предмета. Выходящие из конденсора параллельные пучки лучей равномерно освещают прозрачный предмет в пределах изображения полевой диафрагмы коллектора и дальше падают на объектив 7 микроскопа. Угол, образуемый с оптической осью лучом, выходящим из осевой точки предмета и направляющимся в край зрачка, является передним апертурным углом микрообъектива.

Микрообъектив 7 образует действительное, перевернутое и увеличенное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра 10 (то есть в плоскости полевой диафрагмы 9 микроскопа). В задней фокальной плоскости объектива, где образуется изображение источника света, располагается апертурная диафрагма 8 микроскопа. Выходной зрачок 11 микроскопа, где располагается глаз наблюдателя, является изображением апертурной диафрагмы 8.

Рис. 5. Оптическая система светового микроскопа с осветительным устройством, формирующим освещение по методу Кёлера

Рис. 6. Оптическая система светового микроскопа с осветительным устройством, формирующим освещение по методу Кёлера (менее контрасное изображение)

Наличие в осветительной системе ирисовых апертурной диафрагмы конденсора и полевой диафрагмы коллектора позволяет раздельно регулировать величину числовой апертуры и размер освещаемого поля. На практике эта возможность позволяет эффективно перераспределять световые потоки в осветительной системе, а значит и в оптическом микроскопе в целом. Мы не случайно представили два “одинаковых” рисунка. Если присмотреться внимательно, один из рисунков более контрастный, общее восприятие его, может быть, более удобное и комфортное. Но второй рисунок, который выглядит более “бледным”, позволяет лучше различить мелкие детали.

Это хорошо видно на изображениях би-штрихов у цифр 1" и 3". Таким способом мы иллюстрируем очевидное вытекающее из классической теории микроскопа противоречие между более высоким контрастом (комфортом наблюдения) и максимальной разрешающей способностью для различения минимальных фрагментов структуры исследуемого объекта. Этот постулат достаточно сложно иллюстрировать на фотографиях реальных микроскопических объектов, потому что любая проекционная система “на плёнку” (или электронный приёмник) неминуемо снижает качество изображения в сравнении с визуальным каналом светового микроскопа, не позволяет отобразить такие нюансы. Между тем, именно такими нюансами отличается теория и практика микроскопирования.

Какие же выводы можно сделать из приведённых выше размышлений, какое практическое применение могут иметь изложенные тезисы?

Микроскопы, не имеющие конденсора (вместо него используется поворотный диск с отверстиями различных диаметров) пригодны для “детского сада”, способны обеспечить апертуру не более 0.20, что соответствует объективу увеличением не более 20х. Отсутствует также полевая диафрагма. По условной классификации – “игрушка”.
Микроскопы, использующие конденсор с маркировкой А=1.25. Производители несколько лукавят, поскольку числовая апертура указана для случая использования масляной иммерсии, которую “в реальной жизни” практически никто не наносит.
Без иммерсии числовая апертура конденсора может достигать 0.85, что “приближает” такое устройство к собственно микроскопу, позволяет использовать объективы 40х, 60х и даже 100х ми. В варианте без иммерсии остаточные аберрации конденсора очень велики, предельная разрешающая способность такого микроскопа не может быть максимальной. Наличие ирисовой апертурной диафрагмы конденсора является необходимым, но не достаточным условием для качественного анализа объекта, поскольку позволяет лишь изменять “глубину просмотра” слоёв исследуемого объекта, но не перераспределять световые потоки в микроскопе (что необходимо, если микроскоп использует не один, а несколько объективов с различными увеличениями и числовыми апертурами). Как правило, такие микроскопы не имеют в осветительной системе ирисовой полевой диафрагмы коллектора. Пригодны для целей обучения “в объёме школьного курса”. Весьма спорной является пригодность таких микроскопов для использования в медицинских и исследовательских лабораториях для качественных исследований, особенно, при постановке диагноза. По условной классификации – “мыльницы”.
По условной классификации – “профпригодные”. Понятно, какие микроскопы, имеющие реально работающие ирисовые полевую диафрагму коллектора и апертурную диафрагму конденсора. Как правило, для комплектации таких микроскопов предусмотрена возможность применения нескольких видов конденсоров, отличающихся числовыми апертурами, возможностью использования различного рода иммерсий, аберрационной коррекцией и др. Те из исследователей, кто ещё “застал” старые отечественные микроскопы, могут оценить их осветительные системы с ирисовыми полевыми и апертурными диафрагмами. Это накладной осветитель к Биолам – МикМед-1” (шифр ОИ-21), легендарный микроскоп “Бимам- МикМед-2”, микроскоп исследовательский “Биолам-И”, имеющий ещё и панкратическую (с плавным изменением увеличения) осветительную систему.
Сегодня такие микроскопы, реально (а не рекламно) пригодные для качественных исследований, реализующие описанный метод освещения “по Кёлеру” - ещё поискать. Физическое наличие полевой и апертурной диафрагм – верный ориентир при выборе светового микроскопа, когда исследования должны быть качественными и максимально достоверными.

Следите за анонсами. В течение этого года мы представим несколько статей посвящённых осветительным системам световых микроскопов. Вот примерные темы:

о влиянии аберраций в осветительных системах световых микроскопов.
о необходимости исправления в конденсорах и осветительных устройствах исследовательских и лабораторных микроскопов хроматических аберраций. Особенно это касается хроматических аберраций положения.
о необходимости исправления в конденсорах и осветительных устройствах исследовательских и лабораторных микроскопов аберраций в зрачках. Особенно это касается случаев реализации таких методов контрастирования как фазовый контраст и др.
преимущества применения телецентрического хода лучей в осветительных системах современных световых микроскопов.